清華新聞網(wǎng)1月12日電 基因編輯技術(shù)的迅速發(fā)展為解析復(fù)雜發(fā)育過(guò)程中的基因功能提供了重要工具。然而，相關(guān)技術(shù)在斑馬魚(yú)中的應(yīng)用仍存在一些局限性，例如CRISPR/Cas9介導(dǎo)的全胚基因敲除往往導(dǎo)致胚胎早期死亡，而Cre/loxP條件性敲除系統(tǒng)則受限于loxP序列的種系敲入效率以及位點(diǎn)的限制等因素。上述問(wèn)題在一定程度上阻礙了針對(duì)斑馬魚(yú)時(shí)空特異性發(fā)育調(diào)節(jié)機(jī)制的深入研究。
1月2日，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院孟安明院士課題組在《細(xì)胞生物學(xué)期刊》（Journal of Cell Biology）發(fā)表題為“通過(guò)4-OHT誘導(dǎo)型Cas9在整胚中實(shí)現(xiàn)時(shí)期及組織特異性基因編輯”（Stage- and tissue-specific gene editing using 4-OHT-inducible Cas9 in whole organism）的研究論文。該研究在斑馬魚(yú)中建立了一套生殖細(xì)胞系特異、可誘導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)，并證明通過(guò)4-OHT處理，可在不同發(fā)育階段特異敲除生殖細(xì)胞系中的靶基因，實(shí)現(xiàn)時(shí)間特異性及組織特異性雙重調(diào)控。此外，該誘導(dǎo)型Cas9蛋白在小鼠早期胚胎中同樣可以實(shí)現(xiàn)條件性基因敲除，為跨物種研究提供了潛在工具。
研究團(tuán)隊(duì)基于4-羥基他莫昔芬（4-hydroxytamoxifen, 4-OHT）與突變型雌激素受體（estrogenreceptor, ER）構(gòu)建了4-OHT誘導(dǎo)型Cas9蛋白nCas9ERT2，并在HEK293T細(xì)胞系中驗(yàn)證其在4-OHT處理后可誘導(dǎo)nCas9ERT2蛋白入核進(jìn)行基因編輯。隨后，研究人員構(gòu)建了生殖細(xì)胞系特異表達(dá)誘導(dǎo)型Cas9蛋白轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系Tg（piwil1:nCas9ERT2-n3U）和泛表達(dá)gRNA轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系Tg（U6:gRNAs,cryaa:CFP）。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該誘導(dǎo)型nCas9ERT2蛋白在斑馬魚(yú)胚胎原始生殖細(xì)胞（PGCs）及雌魚(yú)卵母細(xì)胞中均成功響應(yīng)4-OHT誘導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)時(shí)間及組織特異性基因編輯。與傳統(tǒng)的組織特異性基因編輯系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)通過(guò)控制基因編輯的時(shí)間，有效避免了早期胚胎體細(xì)胞脫靶編輯，凸顯該技術(shù)在胚胎早期PGCs研究中的重要價(jià)值。利用該系統(tǒng)，研究人員進(jìn)一步探究了tbx16基因在PGC遷移過(guò)程中的功能，發(fā)現(xiàn)PGC特異敲除tbx16基因會(huì)影響PGC遷移，為理解tbx16在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育中的功能提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，并拓展了對(duì)其參與斑馬魚(yú)PGC發(fā)育過(guò)程調(diào)控的認(rèn)知。
該時(shí)空特異性基因編輯系統(tǒng)及轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系模式圖
清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院副研究員吳小童和孟安明院士為論文通訊作者；2024屆博士畢業(yè)生李雅琪，2025屆博士畢業(yè)生張渭瑩、危子航為論文共同第一作者。生命學(xué)院2019級(jí)博士生李晗、2022級(jí)博士生圖爾蓀江·艾則孜、博士后劉鑫與鄭濤等為研究作出重要貢獻(xiàn)；北京科技大學(xué)副教授幸岑璨參與了課題指導(dǎo)。研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心、膜生物學(xué)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等的資助。
論文鏈接：
https://doi.org/10.1083/jcb.202412216
供稿：生命學(xué)院
編輯：李華山
審核：郭玲
